alt tekst

Kennis delen

Omschrijving

Onze groep doet onderzoek naar de mechanismen die leukocyten gebruiken om hun weg te vinden door de vaatwand. Het belangrijkste doel is het ontrafelen van de signalering routes die worden geïnduceerd in het endotheel door leukocyten. Deze signalering leidt tot de vorming van docking structuren en is vereist voor een goede diapedese. De signalering die veroorzaakt wordt door clustering van adhesiemoleculen zoals ICAM-1 en VCAM-1, is geanalyseerd met behulp van real-time fluorescentie microscopie in combinatie met een fysiologische flow en biochemische en celbiologische assays.

Tijdens dit stageproject leer je om eiwit-eiwit interacties, inclusief biochemische benaderingen zoals immuno-neerslag en Western blotting te onderzoeken. Daarnaast wordt er aandacht besteed aan het meten van de activiteit van kleine GTPases en GEFs door gebruik te maken van specifieke GST pull-down assays. Ook zal er gebruik worden gemaakt van transmigratie van leukocyten door endotheel monolagen in real-time met behulp van flow-based migratie. Bovendien, door de rol van een aantal specifieke eiwitten te onderzoeken, worden RNAi technieken geleerd om belangrijke eiwitten uit te schakelen. Het project wordt afgesloten met een schriftelijk verslag en een mondelinge presentatie voor de afdeling en een klein instituut comité (nog samen te stellen).

Technieken

Voor de productie van GST-fusie-eiwitten worden E.coli bacteriën getransformeerd en gekweekt en zal het eiwit van interesse worden geïsoleerd. Door gebruik van cellen, zoals primaire endotheelcellen of HeLa-cellen, zal de activiteit van GTPases (zoals Rac1, RhoG en RhoA) worden uitgevoerd. Daarnaast wordt door het gebruik van nucleotide-vrije mutanten van specifieke GTPases de activiteit van de GEFs gemeten. Monsters worden geanalyseerd door middel van Western blotting.

Transmigratie assays zullen worden uitgevoerd met behulp van confocale en wide-field microscopie. Met behulp van een 37 C incubator kamer en een gecontroleerde infuuspomp, worden leukocyten (bijv. monocyten en neutrofielen) doorbloedt over de endotheelcellen. Het uitzetten van specifieke eiwitten in de endotheelcellen zal antwoord geven op de bijdrage van deze eiwitten aan dit proces. Indien er voldoende tijd is, zullen we proberen om het transmigratie proces in (4D) beeld te brengen, dat wil zeggen drie dimensionaal in de tijd met behulp van fluorescent-gelabelde eiwitten en confocale laser scanning microscopie.

Laatst bewerkt op: 15 oktober 2015