alt tekst

Kennis delen

Omschrijving

Fysiologische flow wordt meer en meer erkend als een must-have techniek bij het bestuderen van de functie en het gedrag van endotheelcellen in vitro. De techniek is ook belangrijk voor het bestuderen van transendothele migratie van leukocyten. Ons laboratorium maakt gebruik van IBIDI-microslides om de leukocyten-endotheel celadhesie en transmigratie in real-time te onderzoeken. Ook richten we ons op het gedrag en de aanpassing van de endotheelcellen aan verschillende flow condities. We hebben gebruik gemaakt van de (fluorescent) microscopie, flow cytometrie en Western blotting om veranderingen in endotheelcellen-activiteit en eiwitexpressie te analyseren.

Voor de flowcytometrie werden de endotheelcellen meteen na het flow experiment van de microslides verwijderd met behulp van een speciale protease genaamd acutase. Deze protease induceerde geen apoptose of shedding van cruciale oppervlakte markers zoals ICAM-1. De resultaten lieten zelfs een verhoging van ICAM-1 zien na de flow. Bij Western blotting werden de microslides gespoeld met 200μL lysis buffer, waarna het lysaat werd verdund in kokend monsterbuffer. De resultaten toonden ook hier een verhoging van ICAM-1 niveaus aan na de flow. Endotheelcellen reageren op de flow door zich aan te passen aan de richting van de stroming. Bovendien was er zowel vorming van stressvezels als verlenging te zien. Dit werd veroorzaakt door veranderingen in het actine cytoskelet.

In dit stageproject zal in detail worden onderzocht hoe endotheelcellen reageren op verschillende flow omstandigheden, zoals verstoord/turbulente versus laminaire versus statische omstandigheden. Er zullen veel technieken worden gebruikt om dit centrale thema te bestuderen.

Technieken

  • Western blotting en flow cytometrie: om eiwit-expressie en activering te bestuderen.
  • Confocale laser scanning microscopie en scanning electron microscopie: om de morfologische veranderingen op de endotheliale cellen te bestuderen.
  • RNAi technieken, waaronder shRNA of siRNA.
  • Overexpressie van dominant actieve en negatieve mutanten met adenovirale of Lenti-virale leveringsystemen.
  • Moleculaire biologie wordt gebruikt om de vereiste puntmutaties of deletiemutaties te creëren om de betrokkenheid van specifieke eiwitten te bestuderen.
Laatst bewerkt op: 15 oktober 2015